維生素D(vitamin D, VD)是人體內(nèi)一種重要的調(diào)節(jié)因子, 除參與人體內(nèi)鈣磷代謝, 其在高血壓、心血管疾病、腫瘤及糖尿病等疾病中也扮演著重要角色。25 羥基維生素D(25-hydroxy vitamin D, 25(OH)D)是VD在人體內(nèi)的主要存在形式, 性質(zhì)穩(wěn)定(半衰期2 周), 其水平能充分反映食物攝入和自身合成VD 總量, 在精準(zhǔn)藥物治療與營養(yǎng)膳食理念方面具有重要意義, 因此, 需要高準(zhǔn)確測定25(OH)D 濃度水平。25(OH)D的檢測方法,主要包括放射免疫法、酶聯(lián)免疫吸附法、化學(xué)發(fā)光免疫測定法、高效液相色譜法和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法。

1、概述

維生素D(vitamin D, VD)是第4 種被鑒定的能有效治療佝僂病的物質(zhì), 被認(rèn)為是第4種維生素, 因此用字母“D”表示, 為了進(jìn)一步區(qū)分同一類維生素的不同功用, 對(duì)該類物質(zhì)再分配下標(biāo), 進(jìn)而有目前常稱的麥角鈣化醇(ergocalcilferol, VD2)和膽鈣化醇(cholecalcifeol, VD3), 結(jié)構(gòu)式見圖1。醫(yī)學(xué)上應(yīng)用VD 來治療兒童佝僂病已有90 年的歷史, 隨著科技的發(fā)展, 人們對(duì)VD 的認(rèn)識(shí)越來越深入,在過去的20 年有超過50 種的VD 代謝物被報(bào)道, 雖然只有少數(shù)在血液中進(jìn)行了量化。25 羥基維生素D(25-hydroxy vitamin D, 25(OH)D)是VD 在血液中的主要運(yùn)輸形式, 性質(zhì)穩(wěn)定(半衰期2 周), 其水平能充分反映人體通過食物攝入和自身合成后的VD 的總量, 因此體內(nèi)VD水平的評(píng)價(jià)主要通過對(duì)25(OH)D 水平的測定。VD 缺乏是世界范圍內(nèi)備受關(guān)注的公共衛(wèi)生問題, 美國第三次全國健康營養(yǎng)檢查結(jié)果顯示近9 成(≥70 歲)的女性存在每日VD 攝入量不足問題, 即存在發(fā)生VD 缺乏癥風(fēng)險(xiǎn), 多次VD 營養(yǎng)狀況調(diào)查顯示VD 缺乏在兒童、青少年、妊娠期婦女、老年人更易發(fā)生VD缺乏, VD缺乏會(huì)激活腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng), 使人更易患高血壓和導(dǎo)致左心室肥大, 所以應(yīng)有意識(shí)督促對(duì)這類人群從飲食或制劑中攝入充足VD。

VD 是人體內(nèi)一種重要的調(diào)節(jié)因子, 普遍認(rèn)可其對(duì)人體有有益作用, 除了參與人體內(nèi)鈣磷代謝, 近年來的研究發(fā)現(xiàn), 其在高血壓、心血管疾病、糖尿病、腫瘤等疾病中也扮演著重要角色, 低水平的VD 濃度會(huì)對(duì)這些疾病產(chǎn)生負(fù)面影響。研究表明, VD 能促進(jìn)人體對(duì)鈣和磷的吸收,童年時(shí)保證充足的VD 攝入能有效降低老年后患骨質(zhì)疏松的風(fēng)險(xiǎn), 因此VD補(bǔ)充劑, 經(jīng)常與鈣一起作為保健品被服用。攝入人體的VD 主要存在2種形式, 即VD2和VD3,有研究表明由于25 羥基維生素D2(25-hydroxyvitamin D2,25(OH)D2)對(duì)VD結(jié)合蛋白(vitaminD binding protein, DBP)的親和力低于25(OH)D3的親和力, 導(dǎo)致25(OH)D2在體內(nèi)會(huì)被更快速清除,即25(OH)D2和25(OH)D3形式對(duì)人體內(nèi)VD 狀態(tài)的貢獻(xiàn)是不同的。為了進(jìn)一步闡明相關(guān)疾病的病理學(xué)機(jī)制, 流行病學(xué)研究中針對(duì)血清VD 水平的檢測需求出現(xiàn)了驚人的增長, 梅奧醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室報(bào)告VD 檢測量每年增長80%至90%。因VD2 及其代謝產(chǎn)物的血液循環(huán)水平遠(yuǎn)低于VD3及其代謝產(chǎn)物, 有文獻(xiàn)報(bào)道直接將血清中的25(OH)D3 水平作為衡定VD 營養(yǎng)狀態(tài)的指標(biāo)。通過測定25(OH)D2 和25(OH)D3 來評(píng)價(jià)VD 水平, 在精準(zhǔn)藥物治療與營養(yǎng)膳食理念方面具有重要意義。對(duì)25(OH)D 的來源、前處理方法和檢測方法進(jìn)行了概述, 對(duì)選擇合適的25(OH)D 的前處理方法和檢測方法提供理論依據(jù)。

2、體內(nèi)VD 的合成及代謝

VD 是人體必需的脂溶性維生素, 可儲(chǔ)存在脂肪組織中, 也參與血液循環(huán)。血液循環(huán)時(shí)VD 主要和VD 結(jié)合蛋白(DBP)結(jié)合。人體VD 主要來源于膳食攝取和皮膚轉(zhuǎn)化。蘑菇和魚類是較為常見的富含VD 的食物。VD2和VD3 在人體作用機(jī)制完全相同, 但來源不同。其中VD2是由植物中的麥角醇,經(jīng)紫外照射后轉(zhuǎn)變而來,故又名麥角鈣化醇, VD3又被稱為“陽光維生素”是由暴露在陽光或紫外線的皮下前體分子7-脫氫膽固醇轉(zhuǎn)變而來,又名膽鈣化醇。通過皮膚轉(zhuǎn)化或飲食攝取的VD 均具有生物惰性, 要轉(zhuǎn)化成具有生物活性形式還需要經(jīng)過2 次羥基化。首先攝入的VD 在空腸和回腸被吸收后與乳糜微粒或VD 運(yùn)輸?shù)鞍捉Y(jié)合, 經(jīng)血液系統(tǒng)或淋巴系統(tǒng)運(yùn)輸至肝臟,隨后在肝臟中的25- 羥化酶幫助下轉(zhuǎn)化為25(OH)D, 25(OH)D 經(jīng)血入腎, 被近端小管上皮細(xì)胞的線粒體中的細(xì)胞色素P450 氧化酶(1α 羥化酶)催化轉(zhuǎn)化成有活性的1,25- 二羥基維生素(1,25-dihydroxy vitamins,1,25-(OH)2D)(又稱骨化三醇)[4]。該酶活性會(huì)受甲狀旁腺激素水平、血鈣水平和磷調(diào)節(jié)。1,25-(OH)2D 可以與各組織中存在的VD 受體(vitamin D receptor, VDR)發(fā)生相互作用, 如VD核受體即為控制多重的配體依賴性轉(zhuǎn)錄因子,參與細(xì)胞增殖, 免疫反應(yīng)和骨礦化等生物學(xué)進(jìn)程。合成學(xué)家在對(duì)VD 分子的不同部分進(jìn)行修飾后, 現(xiàn)已開發(fā)出3000 種維生素D類似物, 然而只有極少部分有臨床應(yīng)用。當(dāng)體內(nèi)的1,25-(OH)2D 足量時(shí), 會(huì)在腎臟24-羥化酶(renal24-hydroxylase, CYP24)作用下進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為24,25-二羥基維生素D[24, 25-dihydroxy vitamin D,24,25-(OH)2D],最后這些代謝物在膽汁中被分解。此外,1,25-(OH)2D 還能通過活化巨噬細(xì)胞促使其釋放腫瘤壞死因子α, 殺傷或抑制腫瘤細(xì)胞。

總而言之, 人體中VD 會(huì)以多種形式存在, 其主要代謝物是25(OH)D 和1,25-(OH)2D,并主要通過有活性的1,25-(OH)2D 實(shí)現(xiàn)其生理功能, 但由于1,25-(OH)2D 在循環(huán)血液中含量低(pg/mL), 僅為25(OH)D3 的千分之一, 且半衰期短(4~7 h), 檢測時(shí)還易受到多種因素的干擾難以作為臨床指標(biāo)。與之相對(duì)的25(OH)D 是VD 在血液中的主要運(yùn)輸形式, 占體內(nèi)VD 總量的95%, 半衰期長(2 周), 這種相當(dāng)長的血清半衰期可準(zhǔn)確指示一段時(shí)間內(nèi)從紫外線照射和飲食攝入中獲得的VD 水平。25(OH)D 性質(zhì)穩(wěn)定, 其體內(nèi)循環(huán)水平不受血鈣和甲狀旁腺激素(parathyroid hormone relatedpeptide, PTH)水平影響, 更能充分反映體內(nèi)食物攝入和自身合成VD 的總量及VD 的轉(zhuǎn)化能力, 真實(shí)反映人體的VD狀況, 因此臨床上認(rèn)為通過檢測血清中25(OH)D的含量來評(píng)估人體的VD 水平更加可信。

3、VD 相關(guān)性疾病及限量標(biāo)準(zhǔn)

3.1 VD 相關(guān)疾病

傳統(tǒng)觀點(diǎn)中VD 主要生理功能是維持體內(nèi)鈣、磷濃度的平衡。當(dāng)體內(nèi)VD 不足時(shí)(<20 ng/mL), VD 與甲狀旁腺激素的相互作用下降, 會(huì)降低鈣在腸內(nèi)的吸收, 使得人體僅能吸收大約10%~15%的鈣和60%的磷, 從而對(duì)骨健康產(chǎn)生消極影響, 進(jìn)而引起佝僂病、軟骨病、骨質(zhì)疏松等常見病的發(fā)生。在對(duì)手足口病患者、子癇前期患者、白癜風(fēng)患者、乙型肝炎患者、妊娠期糖尿病患者、肺癌患者、慢性心力衰竭等患者的25(OH)D檢測, 發(fā)現(xiàn)其含量較正常人均出現(xiàn)明顯下降且下降程度與疾病嚴(yán)重程度呈正相關(guān), 因此通過檢測25-(OH)D 水平可反映疾病的輕、重程度。也有研究表明補(bǔ)充25-(OH)D可以增強(qiáng)療效, 因此, 臨床上越來越關(guān)注VD 水平的監(jiān)測及補(bǔ)充。

從代謝通路上看, VD 還能通過與蛋白激酶C、促絲裂原活性蛋白激酶、蛋白激酶A、磷脂酰肌醇、Ca2+依賴性電壓門控通道或Ca2+非依賴性電壓門控通道相互作用介導(dǎo)第二信使旁路的激活、影響細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、改變細(xì)胞內(nèi)鈣濃度、激活或抑制Bcl-2、c-jun, 最終影響細(xì)胞增殖、分化和凋亡。VD 具有多種生物作用, 近年的研究發(fā)現(xiàn)VD還是一種神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫調(diào)節(jié)激素, 在自身免疫疾病中發(fā)揮重要作用。如: 在白癜風(fēng)發(fā)病機(jī)制研究中, VD 可抑制自身抗體對(duì)黑素細(xì)胞的殺傷作用, 增加體內(nèi)的黑素細(xì)胞活性和酪氨酸水平。在血糖控制中, 其可以增加胰島素敏感性, 促進(jìn)胰島素合成及分泌, 從而調(diào)節(jié)血糖濃度防治高血壓。流行病學(xué)分析已證實(shí)孕期維生素D 缺乏可增加子癇前期風(fēng)險(xiǎn),可能是發(fā)生子癇前期的病因。25(OH)D3 還可以調(diào)控單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和氣道上皮細(xì)胞等合成抗菌多肽和B-防御素等抗維生素多肽, 起抗呼吸道感染作用。有文獻(xiàn)指出, 較高的VD 攝取和25(OH)D 水平能降低女性患乳腺癌的風(fēng)險(xiǎn)。Gupta 等對(duì)1075 名對(duì)照組的研究結(jié)果表明, 血漿25(OH)D 的水平與乳腺癌的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)呈負(fù)相關(guān),這一負(fù)相關(guān)在產(chǎn)后絕經(jīng)婦女中更加顯著。Ke 等報(bào)道九成以上慢性丙型肝炎患者中存在VD 缺乏或不足現(xiàn)象,25(OH)D 水平的降低會(huì)促進(jìn)肝纖維化的發(fā)展, 從而導(dǎo)致肝硬化或肝癌。及時(shí)補(bǔ)充25(OH)D 能夠降低肝脂肪變性的發(fā)展和組織學(xué)病變的嚴(yán)重程度。吳剛等[28]對(duì)81 例HBeAg 陰性慢性乙型肝炎患者血清中的25(OH)D3 的測定結(jié)果也證實(shí)了患者存在25(OH)D3 缺乏。Querfeld 等證明, 通過人為地補(bǔ)充VD, 作為輔助治療手段能更好地發(fā)揮藥物的抗病毒效果。Bertone-Johnson在對(duì)81183 名50~79 歲的美國婦女血清中的VD 水平研究發(fā)現(xiàn), 高濃度的VD 可以顯著降低患抑郁癥的風(fēng)險(xiǎn)。使用患者血清中25(OH)D 水平來作為乳腺癌、抑郁癥、心血管疾病等多種疾病預(yù)后評(píng)估的參考指標(biāo)具有臨床價(jià)值。目前在中國仍缺乏有針對(duì)性的, 長期的、大樣本的分析, 在體內(nèi)VD 水平研究中, 研究人員還可以在1 年４個(gè)季節(jié)收集多組血樣進(jìn)行25(OH)D 評(píng)估, 驗(yàn)證其是否存在季節(jié)差異性。

3.2 限量標(biāo)準(zhǔn)

美國醫(yī)學(xué)科學(xué)院推薦25(OH)D 血濃度大于20 ng/mL有利于骨骼健康。也有文獻(xiàn)將VD 缺乏定義為血清25(OH)D 低于20 ng/mL, VD 不足為21~29 ng/mL, 充足為30 ng/mL 以上, 而大于150 ng/mL 可能會(huì)導(dǎo)致中毒。還有文獻(xiàn)直接按體內(nèi)血清25(OH)D3水平將VD水平標(biāo)準(zhǔn)分為5 類, 嚴(yán)重缺乏(<25nmol/L)、缺乏(<50nmol/L)、不足(52~72nmol/L)、充足(≥75nmol/L), 正常值(上限為100nmol/L)及中毒(>374nmol/L)。

4、25(OH)D 前處理方法

為了使25(OH)D 測定在臨床生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)室中得到更廣泛的應(yīng)用, 有必要簡化提取程序, 并簡化或消除色譜純化步驟。表1 中列舉了幾種常見的前處理手段, 其大概的流程是: 先將內(nèi)標(biāo)加入血清或血漿中, 然后用有機(jī)溶劑沉淀蛋白質(zhì), 離心后, 進(jìn)行固相萃取(solid phase extraction, SPE)程序, 最后將純化的樣品注入液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀(liquid chromatography-tandem massspectrometry, LC-MS/MS)。目前各種儀器分析方法都涉及復(fù)雜的樣品制備, 這是由于維生素及其代謝物在循環(huán)血液中主要和特異性維生素D 結(jié)合蛋白或白蛋白偶聯(lián), 僅有0.03%的25(OH)D 以游離形式存在, 其在血漿中的濃度在10~50 ng/mL。所以前處理過程中一般需要使用甲醇等有機(jī)溶液使蛋白質(zhì)發(fā)生變性, 將維生素D 從結(jié)合蛋白上釋放出來,也有文獻(xiàn)選擇用NaOH 來破壞蛋白與維生素D 的結(jié)合。然后通過液-液萃取、固相萃取等方法提取、凈化、濃縮樣品中的25(OH)D, Knox 等[38]開發(fā)了一種6 步的自動(dòng)化固相萃取機(jī), 常見的樣品提取劑有正己烷、10%二氯甲烷-正己烷,其中正己烷萃取被認(rèn)為是最簡單的方法, 因其能夠在沉淀蛋白質(zhì)的同時(shí)去除水溶性干擾物。最后萃取物在氮?dú)庀赂稍锖笫褂脧?fù)溶液(甲醇水等)復(fù)溶, 進(jìn)樣檢測。Chen 等開發(fā)了一種免疫親和凈化方法, 在去蛋白的上清液中利用綴合小鼠抗1,25-(OH)2D 單克隆抗體的抗體珠漿, 提取目標(biāo)物后再通過一定的方法將其洗脫, 很好地去除了血清中的基質(zhì)效應(yīng)。隨著科技的發(fā)展, 自動(dòng)化技術(shù)普遍應(yīng)用于前處理過程, 已有專門的自動(dòng)化設(shè)備投入應(yīng)用, 包括一種簡單的蛋白質(zhì)沉淀方式, 利用填充有惰性硅藻土材料的過濾板進(jìn)行自動(dòng)的SPE 程序。自動(dòng)化設(shè)備不但可以增加處理通量,還可以避免在液-液萃取、固相萃取(SPE)和溶劑蒸發(fā)等步驟中由于人為因素帶來的誤差。

5、25(OH)D 檢測方法

目前 25(OH)D 檢測方法主要分為免疫法和色譜法。傳統(tǒng)的免疫法有: 放射免疫法(radioimmunoassay, RIA)、酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA) 、化學(xué)發(fā)光免疫測定法(chemiluminescence immunoassay,CLIA)及色譜法-主要包括高效液相色譜法(high performance liquidchromatography, HPLC)和LC-MS/MS。多數(shù)文獻(xiàn)中檢測25(OH)D 所用生物樣本為血清, 其他樣本還有血漿或干血點(diǎn)等。

5.1 放射免疫法(RIA)

針對(duì)25(OH)D 的放射免疫分析最早于1985 年由Hollis 等提出, 其以3H-25(OH)D對(duì)樣品進(jìn)行加標(biāo), 實(shí)驗(yàn)過程中所有標(biāo)準(zhǔn)品和對(duì)照物均在血清基質(zhì)中并與血清樣品同步提取, 此時(shí)示蹤物3H-25(OH)D 與待測樣品中25(OH)D 競爭性結(jié)合抗25(OH)D 山羊抗體,然后用2 步抗原抗體反應(yīng)以實(shí)現(xiàn)固液分離, 最后通過檢測沉淀中3H 的放射量來計(jì)算樣品中的25(OH)D 的濃度。隨著技術(shù)的發(fā)展,現(xiàn)普遍使用125I-25(OH)D 作為示蹤劑, 通過檢測沉淀中的125I 放射量來計(jì)算25(OH)D 濃度, 該示蹤劑極大地提高了該方法的靈敏度。在較早的研究中由于實(shí)驗(yàn)室間所用質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品不同, 測定方法存在差異, 對(duì)同一血清樣品中25(OH)D 測定結(jié)果往往存在較大的差異。例如, 來自絕經(jīng)后婦女的42 個(gè)樣本被送到實(shí)驗(yàn)室A, 使用乙腈提取并使用他們自己內(nèi)部的放射免疫方法。在42 名患者中, 17%被歸類為維生素D 不足[血清25(OH)D＜80 nmol/L]。來自同一組女性的20 個(gè)不同的標(biāo)本送去實(shí)驗(yàn)室B, 其使用商業(yè)上可獲得的RIA 法制備的試劑盒檢測。該方法測定的血清25(OH)D 值, 90%的女性被分類為維生素D 不足。隨著科技的發(fā)展, 制備出更合適的抗體, RIA 有了巨大發(fā)展。Farrell 等用RIA 法與LC-MS/MS 法對(duì)170 例血清樣品連續(xù)5 d 每個(gè)樣品各重復(fù)測定5 次, 結(jié)果評(píng)估顯示,LC-MS/MS 法一致相關(guān)性為0.99, 平均偏差為1.4 nmol/L。由于該測定法在測定之前不需要樣品預(yù)純化, 靈敏度高,特異性強(qiáng), 對(duì)儀器設(shè)備要求不高, 更適用于基層單位對(duì)超微量物質(zhì)的測定。RIA 測定法被美國食品和藥物管理局批準(zhǔn)用于臨床應(yīng)用(DiaSorin, Stillwater,MN)。但該方法仍存在一些固有局限,如其不能區(qū)分25(OH)D2 和25(OH)D3,只能反映出人體內(nèi)總的25(OH)D 水平, 且最后放射性物質(zhì)的處理上對(duì)檢測人員與環(huán)境存在一定風(fēng)險(xiǎn)。

5.2 酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)

酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)也是VD 測定時(shí)常用的方法,其將25(OH)D 的單克隆抗體結(jié)合在固相載體上, 利用抗原抗體的特異性結(jié)合進(jìn)行定性或定量。該方法多用于試劑盒的制備, 英國IDS 公司與中國博暉創(chuàng)新光電技術(shù)股份有限公司曾推出針對(duì)25(OH)D 的檢測試劑盒, IDS 使用生物素標(biāo)記的25(OH)D, 將其添加到校準(zhǔn)品, 對(duì)照品和25 μL 未經(jīng)染色的血清樣品中。微孔板先包被羊25(OH)D 抗體,然后將稀釋的樣品加入到微孔板中孵育, 讓樣品中的25(OH)D 與固定量的25(OH)D 很好地競爭性結(jié)合微孔板上抗體。在洗滌孔后, 用過氧化物酶標(biāo)記的抗生物素蛋白和四甲基聯(lián)苯胺作為底物, 完成顯色。IDS 酶聯(lián)免疫試劑盒說明書中聲稱所使用的羊多克隆抗體對(duì)25(OH)D3 結(jié)合特異性為100%, 對(duì)25(OH)D2 的結(jié)合特異性為75%。高玲娟等對(duì)IDS 檢測維生素D 的試劑盒進(jìn)行性能驗(yàn)證,結(jié)果顯示: 試劑盒測定25(OH)D 批內(nèi)與批間不精密度均≤5%,定值質(zhì)控品相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差≤8%, 擬合曲線(三次多項(xiàng)式)分析, R2≥0.99, 最低檢出限為5 nmol/L。各項(xiàng)指標(biāo)均達(dá)到美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(Clinical and LaboratoryStandards Institute, NCCLS)的文件標(biāo)準(zhǔn)。張?zhí)煊碌葘?duì)國產(chǎn)檢測血清25(OH)D3 的ELISA 試劑盒進(jìn)行評(píng)價(jià), 批內(nèi)10次測定的變異系數(shù)(coefficient of variation, CV)為9.8%, 批間10 次測定的CV 值為13.2%。每次測定線性相關(guān)系數(shù)均達(dá)到0.999, 最低檢測限為10 μg/L。

葉青等采用ELISA 法對(duì)824 例0~6 歲兒童血清25(OH)D 進(jìn)行檢測, 結(jié)果顯示25(OH)D 的平均值(69.52±57.09) nmol/L, 25(OH)D 缺乏(大于25 nmol/L 且小于50 nmol/L)160 例, 占受檢人數(shù)的19.42%。劉冬妹等用ELISA 法對(duì)1246 例0~6 歲兒童血清25(OH)D3 進(jìn)行檢測, 結(jié)果顯示25(OH)D3的平均值(25.398±7.765) μg/L, 25(OH)D3缺乏(小于20 μg/L)313 例, 占受檢人數(shù)的25.12%。

李曉云等曾以LC-MS/MS 法為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)ELISA 法進(jìn)行了評(píng)價(jià), 選取的50 例患者的血清樣品用LC-MS/MS 法測定25(OH)D3 水平均數(shù)為(14.99±6.51) ng/mL, 用ELISA法測定的均數(shù)為(20.91±9.70) ng/mL, 兩者的相關(guān)性為0.725, 發(fā)現(xiàn)LC-MS/MS 測定值整體低于ELISA, 即使用ELISA法進(jìn)行評(píng)價(jià)維生素D 水平會(huì)低估體內(nèi)維生素D的缺乏, 可能造成臨床決策失誤。

5.3 克隆酶供體免疫測定法(CEDIA)

CEDIA 該測定基于β-半乳糖苷酶的α-互補(bǔ)性原理。試劑盒中酶供體(enzymedonor, ED)標(biāo)記的VD 與樣本中的25(OH)D 競爭結(jié)合VD 抗體, 結(jié)合了VD 抗體的ED 由于空間位阻將不能再與酶受體(enzymeacceptor, EA)結(jié)合形成具有活性的β-半乳糖苷酶。反應(yīng)平衡后, 剩余的未結(jié)合VD抗體的ED 標(biāo)記的VD 與EA 結(jié)合形成具有活性的β-半乳糖苷酶, 因此, 表現(xiàn)為樣本中的25(OH)D濃度與形成的β-半乳糖苷酶活性成比。β-半乳糖苷酶活性的檢測是以2-硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷作為底物, 反應(yīng)生成的產(chǎn)物在415 nm 處有最大吸光度, 通過在415 nm 處測定吸光度的變化值, 即評(píng)價(jià), 批內(nèi)2 個(gè)質(zhì)控10 次測定CV值為1.49%和2.11%, 批間2 個(gè)質(zhì)控3 次測定的CV 值為2.84%和0.97%。線性范圍9~143 ng/mL 線性相關(guān)系數(shù)不低于0.99。

5.4 化學(xué)發(fā)光法(CLIA)

化學(xué)發(fā)光法(CLIA)首先需要將一定的化學(xué)發(fā)光示蹤劑(連接有異魯米諾衍生物的25(OH)D)加入樣品中, 使其與樣品中的25(OH)D 競爭結(jié)合涂覆在順磁珠上的抗血清。待反應(yīng)結(jié)束后加入適量激發(fā)劑(魯米諾和過硼酸鈉), 通過檢測化學(xué)熒光信號(hào)來計(jì)算樣品中的25(OH)D。目前, Ersfeld等開發(fā)的一種針對(duì)25(OH)D 的CLIA 測定法, 與RIA 比較, 相關(guān)系數(shù)為0.94; 與LC-MS/MS 比較, 相關(guān)系數(shù)為0.95, 且該方法已在LIAISON 分析儀上實(shí)現(xiàn)完全自動(dòng)化,單次測定時(shí)間40 min, 平均每小時(shí)能分析90 個(gè)樣品。但由于該抗血清對(duì)25(OH)D2 和25(OH)D3 具有同等效應(yīng), 因此通過該方法測定的仍為總的25(OH)D 水平。以CLIA 為基礎(chǔ)的試劑盒開發(fā)上, 宋翠翠等制備的針對(duì)25(OH)D 化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒最低檢出限4.9ng/mL, 準(zhǔn)確度相對(duì)偏差小于10%, 批內(nèi)變異系數(shù)為6.5%, 批間變異系數(shù)為8.9%。牟夏蓮用化學(xué)發(fā)光法對(duì)477 例7~13 歲小學(xué)生血清25(OH)D 進(jìn)行檢測, 結(jié)果顯示25(OH)D 的平均值(16.93±6.45) ng/mL, 25(OH)D 缺乏(＜20 ng/mL)324 例, 占受檢人數(shù)的67.92%。

在化學(xué)發(fā)光的基礎(chǔ)上發(fā)展的電化學(xué)發(fā)光技術(shù)也被應(yīng)用于25(OH)D 的檢測。劉肖英用電化學(xué)發(fā)光免疫分析法(ECLIA)對(duì)2877 例0~6 歲嬰幼兒血清25(OH)D 進(jìn)行檢測, 結(jié)果顯示25(OH)D 的平均值(82.43±14.26) nmol/L。25(OH)D缺乏(大于25 nmol/L 且小于50 nmol/L)144 例, 約占千分之一。周東芳等用羅氏電化學(xué)發(fā)光法對(duì)3371 例孕婦女血清25(OH)D 進(jìn)行檢測, 3371 例孕婦女25(OH)D 測定平均值為(13.64.±6.484) ng/mL, 25(OH)D 缺乏(＜20 ng/mL)2836 例,占受檢人數(shù)的84.13%?？赡芘c孕婦戶外活動(dòng)減少、缺乏紫外線暴露有關(guān)。

整體而言, 免疫法均較容易受溫度、基質(zhì)、抗體狀態(tài)等因素影響, 批內(nèi)及批間變異系數(shù)(coefficient of variation, CV) 、精密度存在較大的偏差且設(shè)計(jì)的特異性結(jié)合25(OH)D 的抗體和VD 的其他代謝物之間存在交叉反應(yīng)。即維生素羥化物都能與抗體存在不同程度反應(yīng), 通過該方法只能測定得25(OH)D 的總量, 不能滿足同時(shí)測定25(OH)D2 和25(OH)D3 的需求。但該方法對(duì)設(shè)備及操作人員的要求相對(duì)簡單, 在開發(fā)針對(duì)25(OH)D 的試劑盒具有重要意義。更適合自動(dòng)化儀器的應(yīng)用, 在大規(guī)模篩選及檢測VD 上具有不可比擬的優(yōu)勢。

5.5 高效液相色譜法(HPLC)

高效液相色譜法(HPLC)是一種傳統(tǒng)的色譜法, 主要通過液相中的色譜柱實(shí)現(xiàn)將目標(biāo)物分離, 然后再電化學(xué)檢測器或紫外檢測器中檢測。1977 年第一次報(bào)道了25(OH)D的紫外檢測試驗(yàn), 該方法實(shí)現(xiàn)了25(OH)D2 和25(OH)D3 的分離。其靈敏度、特異性、準(zhǔn)確性良好, 可在單次測定中準(zhǔn)確定量多種分析物。

陽利龍等用HPLC 法測定血清中25(OH)D3, 結(jié)果表明該方法擁有良好的精度,在6.7~335.5 nmol/L 濃度范圍內(nèi)線性良好(r=0.9971), 方法回收率在90%~110%之間,萃取回收率大于70%, 日內(nèi)日間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation, RSD)小于6%。葉懷莊等用HPLC 對(duì)2028 名6~11 歲的小學(xué)生中篩檢出晚發(fā)性佝僂病可疑者221人的血漿25(OH)D3 進(jìn)行檢測, 血漿25(OH)D3 在20~320 ng/ml 的濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(R2=0.9992), 方法的回收率為96.34%, 相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.58%, 最小檢出濃度為0.06 ng/mL(S/N=3)。確診晚發(fā)性佝僂病患者151 人中血漿25(OH)D3<10 ng/mL有146 例, 占受檢人數(shù)的96.7%。陳道平等用HPLC 對(duì)30 名肺癌患者和30 名健康人血清25(OH)D 進(jìn)行檢測, 患者血清的25(OH)D 水平是(23.4±7.9) ng/mL 顯著低于健康組的(36.2±7.6) ng/mL。

HPLC 能實(shí)現(xiàn)25(OH)D2 與25(OH)D3 的分離, 但由于25(OH)D2 在血清中的濃度遠(yuǎn)低于25(OH)D3 的濃度, HPLC對(duì)25(OH)D2 的檢測限不能達(dá)到臨床要求, 且該方法所需的樣品量大, 難以滿足臨床上的要求, 又因前處理復(fù)雜且涉及多種有毒有害的有機(jī)試劑,所以目前在臨床上的使用較少, 有逐步被LC-MS/MS 取代的可能。

5.6 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)具有非常高的靈敏度、特異性和準(zhǔn)確性。同位素稀釋LC-MS/MS 更是國際上公認(rèn)的檢測“金標(biāo)準(zhǔn)”。能很好滿足同時(shí)檢測25(OH)D2與25(OH)D3 需求。應(yīng)用該方法在檢測25(OH)D 存在的挑戰(zhàn)主要是, VD在不同離子源下的離子化效果不同, 在合適的離子源選擇上, 由于25(OH)D 具有天然的親脂性, 25(OH)D 缺乏易帶電的基團(tuán), 難以通過常壓化學(xué)電離源(advanced configuration and powerinterface, APCI)或電噴霧離子源(electron sprayionization, ESI)電離。為提高其離子化效率,研究者往往選擇使用衍生化試劑對(duì)其進(jìn)行衍生化, 使其加上一個(gè)富含N 原子的基團(tuán)。在用衍生化試劑對(duì)其進(jìn)行衍生化時(shí), 優(yōu)先選擇將分析物的分子量轉(zhuǎn)移至較高質(zhì)量范圍,從而降低背景噪聲的干擾。最初使用的Cookson 試劑, 形成的Disels-Alder 加合物上含有質(zhì)子親和原子(氧和氮), 該基團(tuán)幫助下能夠讓衍生化產(chǎn)物在正離子ESI 下很容易形成加氫峰[M+H]+, 從而提高對(duì)25(OH)D2 和25(OH)D3 的響應(yīng)值。有文獻(xiàn)報(bào)道使用MEQTAD 作為衍生化試劑可比完整形式提高15 倍靈敏度。然而復(fù)雜的衍生化程序,極大限制了檢測通量, 難以滿足臨床實(shí)驗(yàn)室對(duì)檢測通量的需求。后續(xù)研究者普遍避免進(jìn)行衍生化處理, 有研究提出了通過在流動(dòng)相中添加甲胺, 使其形成甲胺加合離子[M+CH3NH3]+的方式來提高離子化效率?，F(xiàn)使用ESI 時(shí)仍一般通過在流動(dòng)相中添加0.1%甲酸或5 mmol/L 甲胺, 讓分析物形成[M+H]+或[M+CH3NH3]+,以獲得一個(gè)可接受的靈敏度。而在APCI 或者APPI 一般不添加任何電解質(zhì)。

質(zhì)譜法中由于同分異構(gòu)體與目標(biāo)物擁有一樣的質(zhì)荷比,質(zhì)譜儀無法區(qū)分, 在計(jì)算時(shí)將同分異構(gòu)體含量算入目標(biāo)物中, 使得測量結(jié)果偏大。有文獻(xiàn)報(bào)道25(OH)D3 的差向異構(gòu)體在新生兒的血漿的濃度中有顯著貢獻(xiàn)。此外一些內(nèi)源性成分如: 1α-羥基維生素D3、7α-羥基-4-膽甾烯-3-酮, 也會(huì)對(duì)血清中25(OH)D 的準(zhǔn)確測定產(chǎn)生影響, 所以必須選擇合適的洗脫溶液, 設(shè)定合適的洗脫梯度以實(shí)現(xiàn)良好的色譜分離, 確保內(nèi)源性干擾物和分析物被分開。這樣才能建立一個(gè)高靈敏度的人血清中的25(OH)D2 和25(OH)D3 的色譜分析方法。

Tai 等應(yīng)用同位素稀釋的LC-MS/MS, 用APCI 離子源在多反應(yīng)檢測掃描模式下, 25(OH)D3 及其內(nèi)標(biāo)物質(zhì)荷比選擇(m/z 401/383, m/z 404/386),25(OH)D2 及其內(nèi)標(biāo)物質(zhì)荷比選擇(m/z 413/395, m/z416/398)作為定量離子對(duì)進(jìn)行檢測, 離子比為1.4(383.2/401.3)作為陽性鑒定25(OH)D3的附加標(biāo)準(zhǔn)。該測定方法中, 25(OH)D2和25(OH)D3 的加樣回收率達(dá)到99.0%與101.0%, 絕對(duì)回收率達(dá)到97.0%和92%。以信噪比為3 時(shí)作為最低檢測限約為0.15 ng/g, 該方法還具有極高精密度, 當(dāng)25(OH)D ＞ 1 ng/g 時(shí)CV 值為0.2%~0.6%; 當(dāng)25(OH)D＜1 ng/g 時(shí)的CV 值＜2%。曾義8.23%。最低檢測限為2 ng/mL。曾貞等[61]用LC-MS/MS 對(duì)5017 例0~6 歲兒童血清25(OH)D進(jìn)行檢測, 結(jié)果顯示25(OH)D 的平均值69.07 nmol/L。25(OH)D 缺乏(大于25 nmol/L且小于50 nmol/L)939 例, 占受檢人數(shù)的18.71%, 測定VD 相關(guān)化合物的LC-MS/MS 方法匯總見表1。

在提高該方法的檢測限與靈敏度上, 有學(xué)者對(duì)設(shè)備接口、聯(lián)用方式等進(jìn)行優(yōu)化, 如: Petruzziello 等對(duì)ESI-M接口等進(jìn)行改造后實(shí)現(xiàn)超臨界流體色譜與質(zhì)譜聯(lián)用, 該方法能一次性測定包括25(OH)D2 和25(OH)D3 在內(nèi)的14 種脂溶性維生素和類胡蘿卜素。Kushnir 等使用二維色譜分離再通過液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析樣品。

總而言之, LC-MS/MS 檢測方法滿足同時(shí)測定25(OH)D2 和25(OH)D3 在臨床上的要求, 被認(rèn)為是現(xiàn)階段最準(zhǔn)確的檢測方法, 結(jié)果真實(shí)可信, 因此常作為其他檢測方法的參考標(biāo)準(zhǔn)。但從目前來看, LC-MS/MS 仍需要一個(gè)耗時(shí)且復(fù)雜的前處理過程, 許多手動(dòng)樣品制備程度限制了該方法的通量, 復(fù)雜的設(shè)備操作對(duì)操作人員有更高的要求,昂貴的設(shè)備也使其在臨床推廣上存在一定局限。

VD 對(duì)人體健康至關(guān)重要, 體內(nèi)25(OH)D 水平在多種在多種疾病的診斷上具有借鑒作用, 但目前缺乏規(guī)模大、范圍廣、時(shí)間跨度長的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的支撐, 無法量化相關(guān)疾病與25(OH)D 水平具體相關(guān)性。VD 營養(yǎng)狀況調(diào)查顯示, 在兒童、青少年、妊娠期婦女、老年人等人群中普遍存在VD 缺乏問題, 需要在日常飲食加大蘑菇和魚攝入,以保證充足的VD 的攝入。充足的VD 水平在包括抑制自身免疫疾病、調(diào)節(jié)免疫功能、支持心血管系統(tǒng)功能、維持對(duì)皮膚的抗惡性細(xì)胞增殖作用及抑制癌癥進(jìn)展中具有積極作用。RIA、ELISA、CLIA 以及HPL 和LC-MS/MS 均能實(shí)現(xiàn)25(OH)D 水平的測定。

RIA、ELISA、CLIA 法使用的特異性結(jié)合25(OH)D 的抗體較易受溫度、基質(zhì)、抗體狀態(tài)等因素影響, 批內(nèi)及批間CV、精密度存在較大的偏差且特異性結(jié)合25(OH)D 的抗體與其他的維生素羥化物存在不同程度反應(yīng), 通過該方法只能測定得25(OH)D 的總量, 不能滿足同時(shí)測定25(OH)D2 和25(OH)D3 的需求。HPLC 對(duì)25(OH)D2 的檢測限不能達(dá)到臨床要求, 且該方法所需的樣品量大, 難以適用于臨床檢測。同位素稀釋LC-MS/MS法能準(zhǔn)確地測定血清中維生素25(OH)D2 和25(OH)D3, 是公認(rèn)的25(OH)D 的檢測的“金標(biāo)準(zhǔn)”, 通過該方法測定的指標(biāo)有希望成為臨床上的一個(gè)重要指標(biāo), 用于評(píng)估心血管疾病、高血壓、腫瘤糖尿病等疾病風(fēng)險(xiǎn), 尤其在疾病的前期診斷和預(yù)防上有重要意義。該類技術(shù)將不斷成熟, 量化血清、奶粉、米糠等基質(zhì)中25(OH)D 含量, 為不同人群指導(dǎo)補(bǔ)充VD 提供科學(xué)依據(jù)。最后借助分析技術(shù)對(duì)人不同階段的25(OH)D 含量進(jìn)行跟蹤測定, 將維生素營養(yǎng)代謝研究推向更深的層次。

河南美凱生物科技有限公司是一家集研發(fā)、生產(chǎn)、銷售、貿(mào)易于一體的具有獨(dú)立法人資格的新型現(xiàn)代化醫(yī)療器械企業(yè)，公司產(chǎn)品主要涉及血培養(yǎng)瓶,化學(xué)發(fā)光試劑,胃蛋白酶原試劑盒,院感監(jiān)測試劑等系列產(chǎn)品，且均已取得醫(yī)療器械注冊(cè)證。公司占地面積15000平方米，GMP標(biāo)準(zhǔn)廠房3000平方米，專業(yè)性研發(fā)實(shí)驗(yàn)室1000平方米，先后被授予國家高新技術(shù)企業(yè)、河南省工程實(shí)驗(yàn)室、河南省體外診斷試劑工程技術(shù)研究中心等榮譽(yù)稱號(hào)。企業(yè)實(shí)力雄厚，重信用、守合同、保證產(chǎn)品質(zhì)量，以多品種獨(dú)特經(jīng)營的原則，贏得了廣大客戶的信任。垂詢電話0395-3333801。